高效口服胰島素問世,兩性膠束遞送胰島素無需打開緊密連接

相比起用定期針頭註射胰島素治療糖尿病患者,口服蛋白藥物被認為是有效解決方案。口服蛋白質制劑的臨床轉化由於藥物不能有效地穿過腸粘液和上皮細胞層而受到阻礙,這導致其吸收和生物利用度低,且打開緊密連接(緊密連接:又稱閉鎖小帶,相鄰細胞膜共同構成的一個事實上液體無法穿透的屏障。是兩個細胞間緊密相連的區域。它是一類隻在脊椎動物中出現的細胞連接復合物)會引起安全問題。

近日,Nature Nanotechnology刊登瞭由美國韋恩州立大學華人學者曹智強副教授團隊的最新成果。他們報告的兩性離子膠束有望解決上述問題,該膠束具有模擬病毒的兩性離子表面,甜菜堿側鏈和超低的臨界膠束濃度,能夠使藥物通過粘液滲透,並通過轉運蛋白的上皮有效吸收,而無需打開緊密連接。

亮點:

1. 該膠束平臺通過將兩性離子膠束胰島素的冷凍幹燥粉末封裝到腸溶衣膠囊中而用於制備口服胰島素原型樣本。

2. 生物相容性口服胰島素具有高達 40%的高口服生物利用度,提供瞭微調胰島素作用模式的可能性,以及長期安全性,從而可以通過口服方式遞送蛋白質藥物。

美國韋恩州立大學曹智強《Nat.Nanotech.》:高效口服胰島素問世,兩性膠束遞送胰島素無需打開緊密連接

【圖文解析】

作者使用兩性甜菜堿聚合物膠束(DSPE-PCB)來模擬衣殼病毒的表面特征(圖1a),並封裝模型蛋白胰島素。聚羧酸甜萊堿(PCB)通過質子輔助氨基酸轉運蛋白1(PAT1)穿透上皮細胞層(圖1b)。PAT1可以促進甜菜堿和甜菜堿衍生物滲透到上皮細胞層。

兩性離子膠束DSPE-PCB的一項主要優勢是其超低臨界膠束濃度(CMC)低於10-6 mM。與CMC值高幾個數量級的普通表面活性劑相比,這意味著DSPE-PCB分解並在緊密連接蛋白和細胞膜上發揮去污垢作用的可能性很小。經乳果糖-甘露醇腸道通透性測試和透射電子顯微鏡(TEM)表征,DSPE-PCB處理的上皮組織未顯示任何閉鎖小帶打開(圖1c)。

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圖1. 用於口服胰島素的DSPE-PCB膠束的示意圖。a – c,DSPE-PCB膠束平臺可解決粘液(a)和上皮細胞層(b)的障礙,而無需打開緊密連接(c),從而有助於總體上增強腸道吸收。 兩性離子顆粒增加瞭通過粘液的轉運

作者構建瞭由兩性單體和其他中性,帶正電和帶負電的單體與熒光交聯劑交聯而成的納米凝膠顆粒(圖2a)。

盡管這些納米凝膠顆粒粒徑約40 nm,但他們ζ電勢明顯不同(圖2b)。

將這些顆粒與豬的胃粘液溫育,並在共聚焦熒光顯微鏡下追蹤其擴散軌跡。

兩性PCB顆粒的整體平均幾何均方位移(MSD)約為PEG顆粒的6.7倍,是陰離子和陽離子顆粒的100倍甚至更多倍(圖2c))。

這些結果表明,兩性顆粒在粘液中的擴散速度比現有技術中穿透粘液的PEG顆粒快得多。

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圖2. 與包括基於PEG的粒子在內的其他粒子相比。a,不同納米凝膠顆粒的單體和交聯劑結構。b,DLS和Zeta電位。c,納米凝膠在豬胃粘液中運輸。d,DSPE-PCB和聚山梨酯80膠束的結構。e,封裝瞭熒光有效負載的膠束的DLS數據和zeta電位。f,膠束樣品在豬胃粘液中的運輸。

兩性離子膠束通過轉運蛋白增加吸收

兩性離子DSPE-PCB用於通過簡單過程封裝人類重組胰島素,在存在DSPE-PCB和胰島素的情況下,緩慢添加Zn2+,這會導致胰島素沉淀和膠束封裝。DSPE-PCB /胰島素和聚山梨酯80 /胰島素的尺寸低於30 nm(圖3a,b)。經發現,DSPE-PCB輸送註射入糖尿病小鼠的胰島素有效的降低瞭小鼠血糖水平(圖3c)。為瞭研究DSPE-PCB膠束穿過上皮層的潛在途徑,將金納米顆粒封裝其內 。註射後1小時, TEM圖表明位於上皮細胞內部的金納米顆粒證明的轉運蛋白介導途徑(圖3d)。

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圖3. 兩性離子膠束/胰島素:表征,高腸吸收功效和轉運蛋白介導的吸收機制。a,DSPE-PCB /胰島素的TEM圖像。b,DLS數據。c,對糖尿病小鼠的降血糖(藥理)性能比較。d,回腸註射DSPE-PCB /金納米顆粒1小時後上皮組織的TEM圖像

進一步共聚焦激光掃描顯微鏡和流式細胞術對DSPE-PCB /熒光標記的聚苯乙烯納米顆粒進行瞭體外細胞吸收研究。與常規3T3細胞相比,在Caco-2細胞上觀察到瞭DSPE-PCB膠束顆粒的明顯更高水平的細胞攝取(圖4 a–c)。甜菜堿或L-色氨酸明顯抑制瞭Caco-2這種高水平細胞攝取(圖4 a–c)。聚山梨酯80用作非靶向對照,未發現Caco-2細胞可觀察到的聚山梨酯80吸收(圖4 d)。

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圖4. 共聚焦激光掃描顯微鏡圖像(a),兩性離子DSPE-PCB和聚山梨酯80熒光標記聚苯乙烯納米顆粒共孵育(b)和流式細胞數(c)。用DSPE-PCB /熒光標記的聚苯乙烯納米顆粒(網格單位長度= 20 µm;紅色,細胞膜;綠色,聚苯乙烯納米顆粒;藍色,細胞核)孵育的Caco-2細胞的三維可視化(d)。

上皮穿透而不打開緊密連接

作者接著將乳果糖,甘露醇和遊離膠束共同通過回腸註射給健康和糖尿病小鼠。其中采用液相色譜/串聯質譜法(LC-MS-MS)對乳果糖和甘露醇含量進行定量(圖5a,b)。緊密連接打開允許更多的乳果糖(比甘露醇大)通過,並總體上增加瞭排泄的L / M比。與此相反,聚山梨醇酯80和癸酸鈉兩治療組顯示較高的L / M比值。經DSPE-PCB膠束處理的組織顯示出完整的緊密連接,其形態與未經任何膠束處理的對照組織相似(圖5c)。

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圖5. 兩性離子膠束/胰島素處理未打開腸道閉鎖小帶。a,b,對糖尿病(a)和健康(b)小鼠的腸通透性測試。c,回腸註射不同類型的表面活性劑後1小時,上皮組織的代表性TEM圖像。閉鎖小帶用箭頭指示。

口服胰島素原型樣本的開發

通過將直接凍幹的DSPE-PCB /胰島素粉末包裝到M號豬明膠膠囊中,然後進行Eudragit L100-55腸溶包衣程序。基於降糖曲線(圖7a),經計算DSPE-PCB /胰島素膠囊的藥理活性為43.4%,遠高於聚山梨酯80 /胰島素膠囊的8.56%。根據血清胰島素曲線(圖7b),DSPE-PCB /胰島素膠囊的生物利用度計算為42.6%,而聚山梨酯80 /胰島素僅為8.35%。通過改變原型樣本配方中使用的Zn2+的組成,研究瞭降低血糖水平的可行性,和食物對DSPE-PCB /胰島素膠囊的潛在作用(圖7c和d)。在離體熒光成像研究中,進一步檢查瞭口服後不同時間點口服胰島素的吸收部位(圖7e)。

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圖7. 含有兩性膠束/胰島素的口服胰島素膠囊的藥理活性和生物利用度,以及調節藥物作用能力的曲線。

【陳述總結】

總而言之,該文顯示瞭兩性膠束平臺(DSPE-PCB)能夠同時解決粘液和上皮屏障的障礙,並大大增強瞭蛋白質有效載荷(胰島素)在腸道的轉運。通過將DSPE-PCB /胰島素的幹粉包裝到腸溶膠囊中,可以輕松制造口服胰島素原型樣本。與其他臨床前口服胰島素不同,該制劑利用PAT1作為上皮滲透的機制,在微調藥物作用過程中實現瞭高生物利用度和可控制的多功能性,並且不會引起緊密連接打開。

作者簡介

曹智強,2000-2007年獲天津大學高分子材料與工程學士學位和生物醫學工程碩士學位, 2011年獲華盛頓大學化學工程博士學位,師從華盛頓大學華人教授江紹毅。

曾在麻省理工學院David H. Koch綜合癌癥研究所Robert Langer的實驗室,及波士頓兒童醫院和哈佛醫學院麻醉學部任研究員。

現任韋恩州立大學化學工程與材料科學學院副教授。主要研究方向為新材料及其在醫療和生物醫學工程中的轉化應用。

他的研究由國傢科學基金會(NSF),美國國傢衛生研究院(NIH)和青少年糖尿病研究基金會(JDRF)等多項計劃支持。並獲得2016年NIH NIDDK 1型糖尿病探路者獎(DP2)。

全文鏈接:

https://doi.org/10.1038/s41565-020-0693-6

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